制作石蜡切片的步骤与方法

石蜡切片是生物学和医学研究领域中常用的一种技术，它通过将组织样本固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色和封固等步骤，制作成可以在显微镜下观察的薄片。这一技术不仅有助于保存组织的形态结构，还能使细胞内的不同结构呈现明显的颜色差异，便于观察和诊断。以下详细介绍如何制作高质量的石蜡切片。

取材与固定

首先，需要选择适当的新鲜组织样本，并确定取材的具体部位和切割方向（纵切或横切）。取材要迅速，防止组织发生进一步变化，体积也要适中。常用的固定液是FAA（万用固定液），由50%或70%酒精90ml、冰醋酸5ml和福尔马林5ml配制而成。柔软材料使用50%酒精，坚硬材料使用70%酒精。固定时间根据需求而定，短则数小时，长则数月甚至数年，固定液还可以作为保存液使用。

脱水与透明

固定后的组织需进行脱水处理，以去除组织内的水分，便于透明剂和石蜡的渗透。脱水流程依次为70%、85%、95%和100%酒精，每一步持续1-2小时。脱水过程中需保证脱水梯度和每一步的时间，避免过度脱水使组织变脆、收缩。脱水完成后，组织需进行透明处理，使用二甲苯替换出组织内的酒精。透明过程包括二甲苯与酒精等体积混合液1小时，纯二甲苯两次各1小时。

浸蜡与包埋

透明后的组织需浸入融化的石蜡中，使石蜡充分渗透组织，起到支持作用。浸蜡过程分为低温浸蜡和纯石蜡浸蜡两步。低温浸蜡在36℃下将二甲苯和材料的混合液逐步加入碎蜡至过饱和，过夜12-24小时。然后将混合液倒出，加入纯石蜡，更换三次，每次5-24小时。石蜡的熔点选择需根据材料硬度和季节进行调整，较硬的材料和夏季宜使用高熔点石蜡，反之使用低熔点石蜡。

包埋是将浸蜡后的组织块放入装有融蜡的模具中，待蜡块冷却凝固后进行切片。传统方法是将蜡块修成梯形，粘于木块上切片；现代方法使用包埋框，更方便切片。

切片与贴片

切片是将包埋好的蜡块用切片机切成薄片，厚度通常在5-10微米之间。切片前，需调整切片机的角度和厚度，使刀片与组织切面呈15°夹角，切片厚度均匀。切片后，使用粘附剂（如明胶）将蜡片粘于载玻片上，防止在后续操作中脱落。涂抹明胶后，滴加蒸馏水，放上蜡片，用滤纸吸去多余水分，将载玻片放入40℃展片台中烤干。

脱蜡与染色

切片需经过脱蜡和水化处理，才能进行染色。脱蜡使用二甲苯，通过逐步过渡到梯度酒精，最后进入蒸馏水。染色过程常用的方法是苏木精-伊红染色法（HE染色法），使细胞核和细胞质分别呈现蓝色和红色，便于观察。染色流程依次为二甲苯、1/2二甲苯+1/2纯酒精、100%酒精、95%酒精、85%酒精、番红染色4小时以上、95%酒精、固绿染色（迅速）、95%酒精（迅速）、100%酒精、1/2二甲苯+1/2纯酒精、二甲苯、二甲苯，每一步约5-10分钟（特定步骤除外）。染色液需新鲜配制，染色时间根据室内温度、染液新鲜程度等灵活掌握。

封固与镜检

染色完成后，切片需经过脱水、透明处理，最后在载玻片上滴加中性树胶，用盖玻片封固，防止切片变形和污染。封固后的切片放入42℃温箱中干燥过夜，然后贴上标签，标明切片来源、日期等信息。封固剂可选择加拿大树胶或中性树胶。

注意事项

1. 取材与固定：取材动作要迅速，固定液需新鲜配制并充分浸没组织块，固定后的组织应保存在阴凉处，防止变质。

2. 脱水与透明：脱水过程需严格控制梯度和时间，避免组织变脆或变软。透明过程需迅速，防止材料干涸或吸收湿气。

3. 浸蜡与包埋：浸蜡过程需保持温度恒定，操作迅速，避免组织变硬、变脆。包埋时，蜡块应修整成规整形状，便于切片。

4. 切片与贴片：切片前需检查刀片锋利程度，切片过程中需保持切片厚度均匀，贴片时需确保蜡片牢固粘附于载玻片上。

5. 脱蜡与染色：脱蜡过程需彻底，避免残留蜡质影响染色效果。染色过程中需严格控制染色时间和染液浓度，避免染色过度或不足。

6. 封固与镜检：封固前需确保切片干燥，封固过程中需避免气泡产生。镜检前需对切片进行预处理，确保观察效果。

通过以上步骤和注意事项，可以制作出高质量的石蜡切片，为生物学和医学研究提供有力的支持。石蜡切片技术的不断改进和优化，将进一步提高切片质量和观察效果，推动相关领域的发展。